一、 仪器介绍

实验目的：

本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用,包括碱基对突变、移码突变和缺失等,从而评价受试物引起突变的可能性

实验概述：

本试验属正向突变试验,可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物。在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使细胞暴露于受试物一定时间,然后将细胞传代培养。胸苷激酶水平正常的细胞对三氟胸苷trifluorothymidine,TFT等敏感,因而在培养液中不能生长分裂,突变细胞则不敏感,在含有三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。相似的,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基酶(HPRT)正常的细胞对 6-硫代鸟嘌呤6-thioguanine,6-TG敏感,突变的细胞则不敏感,在含有 6-硫代鸟嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落。基于突变集落数,计算突变频率以评价受试物的致突变性。

应用范围

应用于科研、农业、卫生、教育、雾霾状态可吸入颗粒染毒效果研究等各个领域

符合标准：

GB/T 15670.20-2017《农药登记毒理学试验方法第20部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验》

二、试验流程

1细胞培养:

选择合适细胞系如L5178Y、CHO，常规传代培养

2受试物处理:

暴露于不同浓度受试物需设阴性/阳性对照

3表达期:

预留足够时间通常7-10天使突变表型显现。

4.突变体筛选:

TK试验:使用三氟胸苷TFT筛选TK突变体。

HPRT试验:使用6-硫代鸟嘌呤6-TG选HPRT突变体。

5克隆形成分析:

计数突变集落，计算突变频率突变集落数/存活细胞数

6数据统计:

与对照组比较，判断突变率是否显著增加。

三、注意事项

1细胞活力控制:受试物浓度需保证细胞存活率通常>50%

2代谢活化系统:需加入S9混合物(模拟体内代谢，如Aroclor 1254诱导的大鼠肝S9。

3假阳性/阴性:避免pH、渗透压等非特异性因素干扰。

4合规性:   遵循国际指南如OECD 490、ICH S2R1。

计算：