一 仪器介绍

实验目的：

本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用,包括碱基对突变移码突变和缺失等,从而评价受试物引起突变的可能性

实验概述：

本试验属正向突变试验,可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使细胞暴露于受试物一定时间,然后将细胞传代培养胸苷激酶水平正常的细胞对三氟胸苷trifluorothymidine,TFT等敏感,因而在培养液中不能生长分裂,突变细胞则不敏感,在含有三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落相似的,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基酶(HPRT)正常的细胞对 6-硫代鸟嘌呤6-thioguanine,6-TG敏感,突变的细胞则不敏感,在含有 6-硫代鸟嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落基于突变集落数,计算突变频率以评价受试物的致突变性

应用范围

应用于科研农业卫生教育雾霾状态可吸入颗粒染毒效果研究等各个领域

符合标准：

GB/T 15670.20-2017《农药登记毒理学试验方法第20部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验》

二试验流程

1细胞培养:

选择合适细胞系如L5178YCHO常规传代培养

2受试物处理:

暴露于不同浓度受试物需设阴性/阳性对照

3表达期:

预留足够时间通常7-10天使突变表型显现

4.突变体筛选:

TK试验:使用三氟胸苷TFT筛选TK突变体

HPRT试验:使用6-硫代鸟嘌呤6-TG选HPRT突变体

5克隆形成分析:

计数突变集落计算突变频率突变集落数/存活细胞数

6数据统计:

与对照组比较判断突变率是否显著增加

三注意事项

1细胞活力控制:受试物浓度需保证细胞存活率通常>50%

2代谢活化系统:需加入S9混合物(模拟体内代谢如Aroclor 1254诱导的大鼠肝S9

3假阳性/阴性:避免pH渗透压等非特异性因素干扰

4合规性:   遵循国际指南如OECD 490ICH S2R1

计算：